La conquista de los Andes septentrionales fue motivada principalmente por el rumor de que en Quito se encontraba el tesoro de Atahualpa. Se formaron dos expediciones, la de Pedro de Alvarado, desde Guatemala, y la de Sebastián de Benalcázar procedente del sur. Fue éste último el que consiguió llegar primero y quien, el 6 de diciembre de 1534, fundó la ciudad de San Francisco de Quito junto a las faldas orientales del volcán Pichincha. La ciudad se encontraba sobre cenizas, ya que días antes fue incendiada por el General Inca Rumiñahui con el objeto de que los españoles no encuentren nada a su llegada. En agosto, la villa había sido fundada por Diego de Almagro cerca de la ciudad de Riobamba con el nombre de Santiago de Quito.
Sebastián de Benalcázar, fundador de la urbe el 6 de diciembre de 1534.
Debido a los problemas de comunicación y transporte, así como también por la explosión demográfica, el cabildo de la ciudad solicitó al rey Felipe II la creación de la Audiencia y Presidencia de Quito. El 29 de agosto de 1563, él firmó la cédula real que dio nacimiento a esta. La jurisdicción estableció sus límites geográficos, los cuales abarcaban una superficie cinco veces mayor que la de la actual República del Ecuador.
En la Ciudad de San Francisco del Quito, en el Perú, resida otra nuestra Audiencia y Chancilleria Real, con un Presidente: quatro Oidores, que también sean Alcaldes de el Crimen: vn Fiscal: vn Alguazil mayor: vn Teniente de Gran Chanciller, y los demás Ministros y Oficiales necessarios: y tenga por distrito la Provincia de Quito, y por la Costa ázia la parte de la Ciudad de los Reyes, hasta el Puerto de Payta, exclusivé: y por la tierra adentro, hasta Piura, Caxamarca, Chachapoyas, Moyobamba y Motilones, exclusivé, incluyendo ázia la parte susodicha los Pueblos de Jaen, Valladolid, Loja, Zamora, Cuenca, la Zarça y Guayaquil, con todos los demás Pueblos, que estuvieren en sus comarcas, y se poblaren: y ázia la parte de los Pueblos de la Canela y Quixos, tenga los dichos Pueblos, con los demás, que se descubrieren: y por la Costa, ázia Panamá, hasta el Puerto de la Buenaventura, inclusivé: y la tierra adentro á Pasto, Popayan, Cali, Buga, Chapanchica y Guarchicona: porque los demás lugares de la Governacion de Popayan, son de la Audiencia del Nuevo Reyno de Granada, con la qual, y con la Tierrafirme parte terminos por el Septentrion: y con la de los Reyes por el Mediodia, teniendo al Poniente la Mar del Sur, y al Levante Provincias aun no pacificas, ni descubiertas.
El Virrey Pedro Mesía de la Cerda otorgó el título de Presidente interino de Quito con fecha de 17 de mayo de 1766 a Juan Antonio Zelaya y Vergara, que durante este período ejerció sus responsabilidades en calidad de Duque de Quito como comandante general militar y político de dicha provincia
Enriquecida por la explotación minera y la producción textil, pudo construir templos barrocos y mudéjares adaptados con originalidad al ambiente local y los ornamentó con gran profusión de pinturas y tallas, de innegable valor didáctico religioso. Fue la época de la afamadaEscuela Quiteña, obra del mestizaje indio y español.
Los geodésicos franceses del sistema decimal introdujeron en Quito el espíritu racionalista moderno y usaron la magnífica biblioteca de la Universidad Jesuita de San Gregorio. Quito alimentó la extraordinaria empresa de las misiones de Jaén y Mainas. En Quito nació y vivió Mariana de Jesús, santa y patriota. De esta ciudad salió el más ilustre de los precursores de la independencia americana, el mestizo Xavier Chusig quien cambió su nombre a Eugenio de Santa Cruz y Espejo para evitar la discriminación. Espejo fue el fundador del primer periódico de Quito. También hay otras historias como la de Manuela Sáenz, la primera mujer enrolada al ejército bolivariano quien se convirtió en la fiel compañera y novia del libertador Simón Bolívar.